Вопрос 27. Методы диагностики туберкулеза

Вопрос 27. Методы диагностики туберкулеза

1. Бактериологические методы

В соответствии с современными программами ВОЗ основой выявления туберкулеза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю – Нильсену. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулезу животноводческих хозяйств.

Окраска материала по Цилю – Нильсену – наиболее употребимый метод окраски М. tuberculosis. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, размерами не превышающий размер покровного стекла; наливают на бумагу фуксин Циля и осторожно нагревают его на горелке до появления пара, после чего оставляют препарат, чтобы он немного остыл. Затем снимают бумагу с фуксином, ополаскивают препарат водой, опускают в стаканчик с 5 %-ным раствором серной кислоты или смесью 10 частей спирта с 1 частью соляной кислоты, прополаскивают до обесцвечивания. Тщательно промывают водой. Докрашивают любым раствором метиленового синего в течение 3–5 мин. Мазок, окрашенный по Цилю – Нильсену, вместо докрашивания метиленовым синим можно протравить насыщенным раствором пикриновой кислоты (по Шпенглеру). Палочки, устойчивые к кислоте и спирту, окрашиваются в красный цвет, все остальные микроорганизмы – в синий. Окрашенные по Цилю – Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин. Если в окрашенном мазке содержится не менее 5 микобактерий в одном поле зрения (принято смотреть 100 полей), вероятность высева очень высока.

Наряду с мазком в развитых странах золотым стандартом считают посев мокроты на элективные среды (Левенштайна – Йенсена и др.) и определение чувствительности к туберкулостатикам. Но это уже обязанность бактериологических лабораторий, наиболее профессионально работающих при ПТД или учреждениях Госсанэпиднадзора. Сильная бактериологическая служба при неинфекционных больницах скорее исключение, чем правило.

Посев материала на среду Левенштайна – Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4–8 недель. Современные методы с использованием высокоселективных сред позволяют выращивать культуры за 1–2 недели, но идентификация микроорганизма требует дополнительного времени. Современную технику посева считают очень информативной, и в развитых странах в настоящее время не проводят биологические пробы с заражением морских свинок. М. tuberculosis обладает свойством вырабатывать ниацин, что отличает ее от других микобактерий. Для более быстрой идентификации микобактерий разработаны методы гибридизации нуклеиновых кислот.

Если культура выделена, можно определить тип возбудителя и его чувствительность к антибактериальным препаратам. Для дифференциации возбудителя особенно важно определять термостабильность каталазы, поскольку это свойство отсутствует только у М. tuberculosis и М. bovis, наиболее патогенных и вирулентных для человека.

Чувствительность микобактерий к антибактериальным препаратам оценивают с помощью различных методов:

1) диско-диффузионный метод – простейший из них. В агар инокулируют взвесь тестируемого микроорганизма, затем на агар накладывают диск, содержащий антибиотик, а чувствительность определяют посредством измерения зоны подавления роста (оценивают в миллиметрах). Этот метод чаще применяют для определения чувствительности неспецифической флоры, а не микобактерий;

2) во фтизиатрии чаще применяют метод разведения, относимый к стандартизованным методам тестирования in vitro. Микроорганизм инокулируют в тестируемую среду (агар или бульон) и используют серийные двойные разведения антибиотика. Чувствительность определяют измерением концентрации антибиотика, угнетающей рост микобактерий. Таким образом можно определить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) – наименьшую концентрацию в серии двойных последовательных разведений антибиотика, полностью подавляющую видимый рост микроорганизмов;

3) в последние годы распространение получил метод оценки чувствительности бактерий с использованием Е-тестов. Е-тестом называют пластиковую полоску с нанесенным стабильным градиентом концентрации антибиотика. Полоску помещают на агар с инокулированной взвесью микроорганизмов, как и при диско-диффузионном методе. Немедленное высвобождение антибиотика из Е-теста создает стабильный градиент вдоль оси полоски. Соответственно концентрации антибиотика вдоль полоски располагается эллипсовидная зона отсутствия роста колоний, позволяющая считывать со шкалы Е-теста значение МИК. В отличие от диффузии с дисков Е-тест – стандартизированный количественный метод.

Пороговые значения для определения устойчивости: для изониазида – 1 мкг/мл, для рифампицина – 20 мкг/мл, для стрептомицина – 10 мкг/мл, для канамицина – 30 мкг/мл, для виомицина – 30 мкг/мл, для этамбутола – 5 мкг/мл, для этионамида и протионамида – 30 мкг/мл, для циклосерина – 50 мкг/мл, для ПАСК – 10 мкг/мл, для тиоацетазона – 2 мкг/мл;

4) в настоящее время разработаны коммерческие тестовые системы для определения чувствительности in vitro, основанные на методах диффузии и разведения (bioMeriex, Франция; Roche Diagnostics, Швейцария; Giles Scentific, США и др.). Эти тесты в России пока практически недоступны. Многие современные коммерческие тесты используют также ДНК-полимеразный метод (полимеразную цепную реакцию, ПЦР-метод), позволяющий обнаруживать в исследуемом материале буквально считанные микобактерий (10 – 1000 особей) путем идентификации участка ДНК и его многократного повторения (амплификации). Результат исследования может быть получен в течение 2 ч. Несмотря на то что уже имеются коммерческие тест-системы Amplicor и Genprobe, пока широкого распространения ПЦР-метод еще не получил.

В настоящее время происходит изменение системы выявления и лечения туберкулеза. Реальную помощь предлагает фонд Сороса. Его сотрудники провели экономический анализ существующих программ. По их данным стоимость выявления одного больного при проведении массовых обследований посредством флюорографии составляет около 4000 долл., а бактериологически с применением мазка – 1500 долл. Эти цифры обосновывают рациональность внедрения DOTS в условиях сложной экономической ситуации.