Диагностика вирусных гепатитов

Диагностика вирусных гепатитов

Диагностика начинается с обследование больного. Для правильной и своевременной постановки диагноза «вирусный гепатит» врачи сначала обследуют пациента, направляют его на сдачу анализов крови и мочи. В первую очередь они обращают внимание на такие характерные для начального периода этого заболевания симптомы, как вялость, общая мышечная слабость, снижение аппетита, тошнота, неприятные ощущения в животе, потемнение цвета мочи, увеличение и уплотнение печени, повышение болевой чувствительности ее нижнего края. В общем анализе крови врачи обращают внимание на содержание лейкоцитов, лимфоцитов, СОЭ.

Прибегают к проведению биохимических анализов крови и мочи для того, чтобы оценить степень поражения печени и подтвердить, связана ли желтуха с воспалением печени. Наиболее показательным является уровень желчного пигмента — билирубина, образующегося в печени в результате распада эритроцитов. В норме билирубин связывается белками крови и не оказывает токсического действия на ткани организма. При гепатитах концентрация свободного и связанного билирубина в крови резко повышается. Когда она превышает 200–400 мг/л, желтуха становится видимой на глаз.

Говорит о повреждении гепатоцитов возрастающий уровень активности трансаминаз — АлАТ и АсАТ, которые попадают в кровь из клеток печени сквозь поврежденные оболочки. Существуют также специальные тесты на состояние системы свертывания крови, в которой участвуют белки, синтезируемые в печени. Диагностическое значение имеет положительная реакция мочи на уробилин.

Свидетельствующим о нарушении функции печени, является показателем — тимоловая проба. Изменение протромбинового индекса характеризует тяжесть течения вирусного гепатита, а повышение активности щелочной фосфатазы, общего билирубина свидетельствуют о нарушении секреторной функции печени. Реакция мочи на желчные пигменты в начале болезни бывает положительной значительно реже.

В диагностике немаловажное значение, как острых, так и хронических форм вирусных гепатитов отводится ультразвуковому обследованию органов брюшной полости. С помощью этого метода врачи могут определить такие изменения, которые не обнаруживаются при внешнем обследовании: увеличение печени, сужение печеночных вен, уплотнение и утолщение их стенок, признаки воспаления желчного пузыря и поджелудочной железы, расширение воротной и селезеночной вен, увеличение селезенки, увеличение лимфатических узлов. Важнейшим методом диагностики, в особенности хронических гепатитов, является биопсия печени.

Методы обнаружения антител и антигенов в крови и других жидкостях организма включает в себя серологическая диагностика. Для ранней диагностики вирусных гепатитов, в том числе безжелтушных, бессимптомных форм, в сыворотке крови определяют наличие вирусных белков (антигенов, которые еще называют маркерами вирусных гепатитов) или антител к ним с помощью иммупоферментного анализа (ИФА). Кроме того, ИФА по возможности дополняется полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяющей определить наличие в сыворотке крови вирусных нуклеиновых кислот — ДНК вируса гепатита В, РНК вирусов других гепатитов, что особенно важно для начала своевременного лечения.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — является универсальным методом иммунологической диагностики, который широко используется на практике. Он предназначен для выявления вирусных белков (антигенов) или антител, которые вырабатываются иммунной системой в ответ на проникновение вирусов в организм человека. Эти белки являются своеобразными маркерами (метками) или признаками, наличие которых позволяет поставить точный диагноз, оценить характер заболевания, помочь лечащему врачу выбрать правильное лечение. Этот метод основан на известном взаимодействии «антиген-антитело».

Для определения антигенов различные коммерческие фирмы выпускают тест-системы, которые представляют собой 96-луночные полистироловые планшеты. На дно лунок заранее сорбируют («пришивают») антитела к тому или иному антигену возбудителя, например, к поверхностному антигену вируса гепатита В — HBs-антигену. На первом этапе в каждую лунку добавляют образец, например, сыворотку крови больного в разных разведениях, содержащую пока не определенный вирусный белок (антиген). Если этот белок (антиген) «узнал» свое антитело, то происходит их связывание. Это означает, что сыворотка больного содержит тот антиген, антитела к которому сорбированы на дне планшетки. Для того чтобы увидеть результаты этой реакции, существует следующая стадия, на которой к комплексу «антиген-антитело» добавляют соединение, которое связывается с антителом. Это соединение содержит фермент, например, пероксидазу хрена. При добавлении к нему субстрата происходит расщепление последнего с последующим окрашиванием раствора в желто-коричневый цвет.

На следующей стадии проводят тщательную промывку каждой лунки от непрореагированных компонентов. В тех лунках, где антиген, как в нашем случае, полностью связан с антителом, он уже не может взаимодействовать с добавляемым соединением. Поэтому оно удаляется из лунки при отмывании. По мере разведения сыворотки содержание в ней антител снижается, и они уже не в состоянии полностью связать антиген. В этих лунках соединение, содержащее фермент, связывается с антигеном и остается в лунке после промывания. На следующей стадии добавляют субстрат и смотрят результаты реакции, которые оценивают визуально или с помощью спектрофотометра.

Таким образом, мы выявили, что в образце сыворотки от больного содержится HBs-антиген. Можно также выяснить его количество или титр, определив то последнее разведение сыворотки, где появилось желтое окрашивание. Чем больше степень разведения, тем больше вируса содержится в крови больного.

Подобным образом можно определить наличие антител к тому или иному возбудителю вирусного гепатита. Только в этих случаях используют диагностические тест-системы с «пришитыми» на дно лунок не антителами, а известными антигенами. Достоинствами этого метода являются высокая чувствительность и специфичность, простота постановки реакции, возможность обследования одновременно большого количества пациентов. Среди недостатков метода можно отметить необходимость специального дорогостоящего оборудования и соответствующей квалификации персонала.

Метод полимеразной цепной реакции — это молекулярная клиническая диагностика. Она включает в себя определение белков (антигенов), а также нуклеиновых кислот (или их характерных участков) — возбудителей разных заболеваний. Она начала особенно интенсивно развиваться в начале 1970-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии (создание моноклональных антител и открытие в 1985 году метода ПЦР). Эти достижения существенным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику па принципиально иную высоту — уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биологической среде.

При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена одна искомая молекула нуклеиновой кислоты среди миллионов других. С точки зрения клинической медицины определение нуклеиновой кислоты равнозначно обнаружению возбудителя в объекте исследования.

Из биологии известно, что нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) обладают свойством к саморепродукции (воспроизводству). Этот принцип и лежит в основе метода ПЦР, когда этот процесс осуществляется искусственно в лабораторных условиях. Для этого из полученного от больного образца ткани (например, в случае подозрения на вирусный гепатит) выделяют сначала нуклеиновую кислоту. Она выполняет роль своеобразной «матрицы», на которой осуществляется синтез. Нуклеиновая кислота имеет свой «отпечаток» — уникальную последовательность нуклеотидов, из которых она состоит. Для каждого возбудителя такая последовательность изучена, составлена своеобразная «карта».

Самый главный элемент в ПЦР — это праймер (короткие участки ДНК, комплементарные (соответствующие) участкам выделенной из образца нуклеиновой кислоты). Праймеры обеспечивают запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси нуклеиновых кислот испытуемого образца, праймера и специальных ферментов (полимераз)) с помощью которых эта реакция невозможна. ПЦР-анализ включает несколько циклов (этапов), в результате которых получаются точные копии распознаваемого участка матричной нуклеиновой кислоты. Эти циклы повторяются 30–50 раз в соответствии с заданной программой. Конечный продукт этой реакции распознается с помощью метода электрофореза в геле.

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий ДНК или РНК в 1 мл раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую нуклеиновую кислоту, даже если ее концентрация составляет несколько сот копий в 1 мл образца. С этим связано общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем — диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности — «специфичность», которая определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100 %.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят показатели, обеспечиваемые другими методами, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что ИФА имеет чувствительность 50–70 %, а ПЦР — от 90 до 100 %.

ПЦР, по сравнению с ИФА и другими способами, обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью анализа по времени, то есть «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Перед другими методами клинической лабораторной диагностики существуют преимущества ПЦР:

— метод позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда с помощью других способов это сделать невозможно;

— метод обладает высокой специфичностью (до 100 %). Она обусловлена тем, что в исследуемом «материале определяется уникальный фрагмент нуклеиновой кислоты, характерный только для данного возбудителя или гена;

— возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания нуклеиновой кислоты. В настоящее время с помощью коммерческих тест-систем можно определять несколько сот копий в исследуемом образце;

— высокая технологичность и автоматизация метода позволяют врачу получить результаты исследования и ознакомить с ними пациента в день проведения анализа;

— ПЦР позволяет выявить возбудителя в организме еще до развития заболевания, например, в инкубационном периоде;

— для проведения ПЦР—анализа достаточен минимальный объем пробы (до нескольких микролитров);

— ПЦР-анализ позволяет одновременно диагностировать несколько возбудителей заболеваний в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата;

— полученные результаты ПЦР можно вносить в компьютерные информационные носители или фотографировать для дальнейшей оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований:

— высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-систем и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории;

— неоднозначная оценка положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом врачей-практиков для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Например, у лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК возбудителя клинически заболевание может развиться не всегда. В данной ситуации при оценке ПЦР-анализа следует говорить об инфицированное больного, а не о развитии инфекционной болезни. Метод ПЦР — анализа позволяет определять наличие или отсутствие возбудителя, в значительной мере отвечает на вопрос «лечить не лечить», а также дает возможность оценить качество лечения путем контроля наличия или отсутствия возбудителя. Врач, оценивая итог ПЦР-анализа, осознает, что этот результат является не единственным аргументом в принятии решения о начале лечения или отказе от него.

Для каждого вида возбудителя вирусных гепатитов разработаны тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатитов В, С, D, G. Метод ПЦР является крайне важным для диагностики гепатита В. Это связано с тем, что среди множества разновидностей этого вируса встречаются мутантные (с измененными признаками), которые не определяются обычными серологическими тестами. Метод ПЦР-анализа позволяет выявить, и какой форме находится вирус гепатита 15, способен ли он к самостоятельному размножению или интегрировался (встроился) в ДНК клетки-хозяина. Это имеет крайне важное клиническое значение, так как при интегративной форме этой инфекции человек не заразен для окружающих (безопасность для полового партнера, профессиональная пригодность, отсутствует риск вертикальной передачи вируса от матери к плоду и т. п.). Кроме того, таким пациентам не показана противовирусная терапия, более того — она даже опасна. Вместе с тем, при интегративной форме инфекции резко возрастает (более чем в 200 раз) вероятность развития рака печени. Таким людям необходимо не менее одного раза в год проходить комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование.

Метод ПЦР может выступать в качестве арбитра для определения необходимости начала лечения и контроля его эффективности. Быстрое исчезновение из крови ДНК вируса гепатита В является прямым и надежным тестом успешного исхода противовирусного лечения.

Таким образом, определение ДНК вируса гепатита В в плазме крови является важнейшим анализом, который в совокупности с другими лабораторными исследованиями позволяет объективно диагностировать инфекцию, определять характер инфекционного процесса, выступать в качестве критерия в проведении терапии и оценки ее эффективности.

Метод ПЦР—анализа не имеет себе равных и в диагностике, оценке прогноза и успеха противовирусной терапии инфекции, вызванной вирусом гепатита С. Применение ПЦР позволяет выявлять вирус гепатита С на самом раннем этапе инфекционного процесса, поскольку РНК вируса гепатита С может обнаруживаться в сыворотке крови уже через неделю после инфицирования. С помощью этого метода определяют генетические разновидности этого вируса, которые позволяют врачу назначить правильное лечение.

В случае вирусного гепатита D метод ПЦР-анализа позволяет определить вирусную РНК в сыворотке крови пациента, а также смешанную гепатит В и D инфекцию. Поэтому данный метод исследования может использоваться для контроля эффективности лечения, прогноза течения и исхода болезни. Врачу важно определить, имеется ли смешанная инфекция, так как гепатит D усиливает некротический эффект при гепатите В, а, стало быть, повышает риск его развития.

Метод ПЦР-анализа в настоящее время остается единственным способом доказать наличие заражения вирусом гепатита С.

Рассмотрим применение методов диагностики для разных гепатитов

Гепатит А. Диагноз вирусного гепатита А врач устанавливает на основании опроса больного (например, пребывание его в очаге гепатита А за 15–40 дней до заболевания), острого начала заболевания, короткого начального периода, напоминающего грипп, расстройств пищеварения (потеря аппетита, тошнота, рвота, боли в животе) с 3—5-го дня болезни, быстрого развития желтухи, преимущественно непродолжительного желтушного периода (в среднем 2 недели). Диагноз гепатита А подтверждается, если удается обнаружить вирус в фекалиях, собранных в острой стадии заболевания. Специфическим методом лабораторной диагностики гепатита А является выявление с помощью ИФА в сыворотке крови больного специфических антител, принадлежащих к иммуноглобулинам класса М. Они могут быть выявлены уже через 3–5 дней после появления первых симптомов и сохраняются в течение 4–6 месяцев. На этом методе построены все современные тест-системы, выпускаемые в промышленных масштабах для диагностики гепатита А.

Гепатит Е. Основными диагностическими признаками вируса гепатита Е являются: предположение о водном механизме передачи, возраст больного от 20 до 40 лет, распространение в регионах преимущественно тропического и субтропического пояса, клинические проявления подобно гепатиту А с преобладанием легких форм, регистрация тяжелых форм с угрозой летального исхода у беременных женщин во второй половине беременности, реже — в раннем послеродовом периоде и у кормящих матерей (протекают с интенсивным гемолизом, гемоглобинурией, острой почечной недостаточностью и тяжелым тромбогеморрагическим синдромом). Подтверждает диагноз выявление антител в крови.

Гепатит В. Вирусный гепатит В врачи подозревают в случае, если заболевшему за 45-180 дней до начала болезни переливали кровь или ее компоненты (эритроцитарную, лейкоцитарную, тромбоцитарную массу), проводили оперативные вмешательства, исследования внутренних органов, многочисленные инъекции (в том числе наркотиков), или, что случается гораздо реже, если больной имел половой или тесный контакт с больным гепатитом В. Критерием раннего подтверждения диагноза служит обнаружение в крови HBs, НВе и НВс-антигенов, а также вирусной ДНК.

Серологические маркеры при остром гепатите В

Гепатит С. В отличие от гепатита В, в диагностике которого учитываются антигенные и антительные маркеры, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела, что связано с низкой концентрацией вируса в крови. Антигены вируса гепатита С могут быть обнаружены в биоптатах печени.

Лабораторная диагностика включает в себя три основных вида анализов.

Серологические маркеры при остром гепатите С

Определение антител. Несмотря на высокую специфичность, современные диагностические иммуноферментные системы не застрахованы от гипердиагностики, то есть отложноположительных результатов. Для их исключения также требуется оценка на основе результатов анализов, полученных через разные промежутки времени. Возможны и ложноотрицательные результаты, когда антивирусные антитела не удается обнаружить, несмотря на присутствие вируса в организме. Это бывает в следующих случаях:

— начальный период заболевания;

— во время приема больными иммунодепрессантов — препаратов, подавляющих иммунную систему;

— при заражении некоторыми генотипами (прежде всего 3 и 4).

В настоящее время выпускаются коммерческие тест-системы для выявления антител к вирусу гепатита С 1-го генотипа. Однако такие тесты могут быть недостаточно эффективны для надежного определения антител при инфицировании вирусом иного генотипа. Это имеет огромное значение для регионов, где превалируют вирусы других типов. Таким образом, для эффективной диагностики гепатита С необходим высокочувствительный тест, способный реагировать с антителами к вирусу гепатита С любого генотипа.

Определение вирусной РНК. С диагностической целью производится обнаружение РНК вируса гепатита С. На сегодняшний день этот тест считается «золотым стандартом» в диагностике гепатита С. Для этого наиболее широко используется классический вариант полимеразной цепной реакции (ПЦР). С ее помощью удается следить за размножением вируса, а также судить о присутствии его в печени и других тканях. Определение РНК наиболее часто применяют для подтверждения результатом выявления антител, постановки раннего диагноза острою гепатита (вирусную РНК удается обнаружить уже на 7-21-й день после инфицирования, то есть задолго до появления первых антител), для наблюдения за беременными в перинатальный период заражения и контроля за эффективностью антивирусной терапии.

Данные этих двух анализов хорошо дополняют друг друга. Положительные результаты ПЦР-анализа в сочетании с отрицательными результатами на антивирусные антитела характерны для некоторых периодов острого гепатита. Негативные показатели ПЦР-анализов на фоне положительных антительных тестов могут быть следствием низкой (не улавливаемой в ПЦР) концентрации вируса в крови. Повторные положительные ПЦР-анализы крови отражают активацию вируса в клетках печени или других органов.

Также ПЦР применяется для обнаружения вируса в тканях печени, взятых при биопсии. Это дает более полную информацию о развитии инфекционного процесса, так как вирус способен длительное время находиться в гепатоцитах, не выходя в кровь или присутствуя в ней в низких концентрациях. Это чаще происходит на ранних этапах инфекции, но наблюдается и при хроническом гепатите.

Определение белков (антигенов) вируса гепатита С. Принципиальная возможность выявления белков вируса гепатита С была установлена вскоре после открытия вируса при иммунофлюоресцентном изучении тканей, взятых из печени больных хроническим гепатитом С людей и шимпанзе, зараженных этим вирусом. Определение вирусных белков (антигенов) в сыворотке крови из-за их низкого содержания долго не удавалось. Лишь недавно были разработаны методические подходы для иммуноферментного выявления внутреннего С-белка в крови и организовано производство первых коммерческих тест-систем. Их внедрение в практику позволит решать спорные вопросы диагностики на более экономичной основе, чем определение вирусной РНК. Определение уровней АлАТ является наиболее дешевым методом оценки активности течения гепатита С. Однако однократно полученные данные могут быть недостаточными для определения тяжести заболевания.

Более важную информацию относительно поражения печени может дать определение концентрации АлАТ в течение нескольких месяцев. Получить информацию о степени поражения печени, недоступную при других методах исследования, может дать врачу биопсия печени. Данные, полученные в результате этой процедуры, позволяют принять решение в пользу начала или отмены противовирусного лечения.