Лабораторные методы

Лабораторные методы

Иммуногематопогические исследования

В 1954 году A. Allen и соавторы обнаружили прямую зависимость тяжести гемолитической болезни у новорожденных и высоты суммарного титра антиэритроцитарных антител в крови матери. Такую же закономерность описали позднее Л. С. Персианинов (1959) и 3. Ф. Васильева (1972). Особенно неблагоприятные перинатальные исходы все авторы наблюдали в тех случаях, когда антитела впервые выявлялись уже в начале беременности. В результате исследований было показано, что не имеется прямой и постоянной связи между высотой суммарного титра анти-эритроцитарных антител, выявляемых в крови беременной женщины, и формой гемолитической болезни, возникающей у плода. Попытка использовать в диагностических целях динамику титра антирезусных антител в течение беременности, привела к более обнадеживающим результатам, однако она также не оказалась решающей в оценке тяжести заболевания у плода.

Вопрос о связи титра антиэритроцитарных антител у матери с тяжестью гемолитической болезни у плода является предметом дискуссии до настоящего времени. По наличию и уровню титра иммунных антител в крови женщины можно установить характер антигенных взаимосвязей матери и плода. Однако однократное исследование его уровня не достаточно точно отражает вероятность наличия гемолитической болезни у плода. Беременная, имеющая титр антиэритроцитарных антител 1:64, в такой же мере может иметь тяжелую степень заболевания плода, если титр будет сохраняться на прежнем уровне, как и беременная с возрастанием титра антител от 1:32 до 1:256 в этом же гестационном сроке.

Исследования, проведенные в НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, показали, что у беременных, имевших в анамнезе гемолитическую болезнь плода и новорожденного, суммарный титр антиэритроцитарных антител был достоверно выше, чем у женщин, не имевших такого анамнеза. При этом величина суммарного титра не зависела от перенесенных беременной в прошлом гинекологических и соматических заболеваний, а также акушерских осложнений данной беременности.

Удалось выявить, что высота суммарного титра антиэритроцитарных антител не коррелировала с выраженностью ультразвуковых биометрических маркеров гемолитической болезни плода, выявленных у беременной при ультразвуковом исследовании: толщиной плаценты, количеством околоплодных вод, размерами печени и селезенки плода, наличием отечного синдрома. Однако суммарный титр прямо коррелировал с величиной максимальной систолической скорости кровотока в средней мозговой артерии плода, как на протяжении беременности, так и перед родами. Кроме того, была обнаружена прямая корреляционная связь между величиной титра антител в крови матери и частотой выявления тяжелой анемии в крови плодов, полученной при кордоцентезах. Однако тяжесть анемического синдрома, обнаруженного у плода, от суммарного титра антиэритроцитарных антител не зависела. Кроме того, оптическая плотность (при длине волны 450 нм) околоплодных вод, полученных у таких беременных во время амниоцентеза, не зависела от высоты суммарного титра в крови матери.

Кроме того, в наших исследованиях установлено, что чем выше был суммарный титр антиэритроцитарных антител в крови матери, тем тяжелее было общее состояние ее новорожденного. Было обнаружено, что чем выше был суммарный титр антиэритроцитарных антител в крови беременной при первом обращении к врачу, тем раньше она была родоразрешена и тем ниже была оценка новорожденного по шкале Апгар. Число эритроцитов, значения гемоглобина и гематокрита в крови, полученной из пуповины сразу после рождения, от величины суммарного титра антиэритроцитарных антител в крови матери не зависели. Однако их величины прямо коррелировали с содержанием в пуповинной крови билирубина.

Обобщая полученные в научных исследованиях, проведенных в НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, данные можно заключить, что при изоиммунизации суммарный титр антиэритроцитарных антител нарастает в динамике беременности, достигая максимальных значений в третьем триместре. На фоне тяжелой аллоиммунизации самое значительное нарастание суммарного титра наблюдается после 28-й недели. При этом тяжесть сенсибилизации у беременных зависит от паритета и наличия отягощенного гемолитической болезнью плода и новорожденного анамнеза у матери. При этом, чем выше суммарный титр антиэритроцитарных антител в крови матери, тем чаще развивается у плода анемический синдром, однако степень его тяжести от высоты титра не зависит. Подобная зависимость не обнаружена у новорожденных этих женщин.

В настоящее время суммарный титр антиэритроцитарных антител принято определять всем резус-отрицательным беременным, имеющим иммуноконфликтный брак, в основном, с целью выявления у них самого факта сенсибилизации.

Всем беременным при первом обращении к врачу определяют группу крови и резус-фактор, даже если в жизни пациентки подобное исследование уже проводилось, и она имеет его заключение. При выявлении у беременной резус – отрицательной крови или О (I), А (II) или В (III) группы крови следует определить группу и резус-принадлежность крови отца для решения вопроса о принципиальной возможности развития иммуноконфликтной беременности.

Для исключения ошибок в определении этих показателей всем беременным исследования повторяют в 28–30 недель. При несовпадении результатов первого и повторного исследования кровь направляют на исследование в централизованную лабораторию или на станцию переливания крови.

Первичное определение группы крови проводят моноклональными антителами или стандартными изогемагглютинирующими сыворотками. Подтверждающее исследование проводят в лаборатории перекрестным способом на плоскости или агглютинацией в геле. Заключение о групповой принадлежности делают на основании первичного и подтверждающего исследования.

Резус-принадлежность крови беременных определяют двумя сериями реактивов анти-D-следующими методами: методом в пробирках без подогрева с использованием универсального реагента анти-D, методом агглютинации на плоскости с применением моноклональных антител, методом конглютинации в пробирках с желатином или 33  % полиглюкином, гелевым методом, антиглобулиновым тестом с использованием сыворотки анти-D (реакцией Кумбса).

В трудно диагностируемых случаях определения резус-принадлежности крови проводят непрямой антиглобулиновый тест. Резус-принадлежность крови беременных, имеющих слабый антиген D (по результату, выраженному в крестах), считают положительной.

Одновременно с определением групповой и резус-принадлежности крови проводят исследование антител к антигенам эритроцитов системы Резус и другим клинически значимым системам антигенов эритроцитов. Титрование антител проводят одним из методов: антиглобулиновым тестом, гелевым тестом или методом с применением 10 % желатина. Исследование проводят независимо от резус-принадлежности крови беременной.

Все беременные после первичного исследования на наличие антител распределяются на две группы: сенсибилизированные и несенсибилизированные. Повторные исследования целесообразно проводить в одной лаборатории одним и тем же методом.

Беременным, имеющим D-отрицательную принадлежность крови, у которых при первом обращении в консультацию антитела не были выявлены, повторное их исследование проводят в 28–30 недель для решения вопроса о целесообразности проведения первого этапа иммунопрофилактики. Такой подход оправдан, если на более ранних этапах беременности отсутствуют акушерские или экстрагенитальные факторы риска развития сенсибилизации, требующие досрочного повторного определения наличия антител.

Если скрининг антител дает положительный результат, то величина титра антител, полученная при первом исследовании, рассматривается как базовая. Существенно напомнить, что для оценки тяжести заболевания у плода и прогноза исхода беременности у сенсибилизированной женщины информации о суммарном титре антител, даже в случае его высокой величины, недостаточно.

У сенсибилизированных беременных проводят идентификацию антител с определением субклассов. Сроки исследования антител зависят от специфичности выявленных антител.

Беременным, сенсибилизированным к антигенам системы Резус или имеющим клинически значимые антитела к антигенам других систем, контроль титра антител до 32 недель беременности проводят 1 раз в 4 недели. После 32 недель контроль титра проводят 1 раз в 2 недели.

Контроль титра антител к антигенам эритроцитов системы АВО проводят при первичном обращении и в 36 недель беременности для решения вопроса о необходимости досрочного ее прерывания. Тяжесть гемолитической болезни плода и новорожденного, обусловленной несовместимостью крови матери и плода по системе АВО, не коррелирует с величиной титра антител, поэтому отсутствует необходимость более частого его определения.

Беременным, у которых выявлены антиэритроцитарные антитела, не имеющие клинического значения в патогенезе иммунного конфликта во время беременности, динамику титра антител повторяют в 28–30 недель беременности для выявления клинически значимых антител, которые могут вырабатываться в более поздние сроки беременности.

В исследованиях, проведенных в НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, было выявлено, что приблизительно у половины всех сенсибилизированных беременных выявлялись только анти-D-антитела. В остальных случаях они определялись у беременных в сочетании с другими типами антиэритроцитарных антител. При этом анти-Е антитела у пациенток всегда выявлялись в сочетании с анти-С антителами.

Было показано, что у беременных, имеющих в крови анти-С антитела, при ультразвуковом исследовании патологические значения толщины плаценты определяются чаще, по сравнению с теми женщинами, у которых анти-С не выявляются. Кроме того, максимальная систолическая скорость кровотока в средней мозговой артерии плодов была выше у тех получавших внутриутробные трансфузии беременных, которые имели в крови анти-Е антитела, по сравнению с теми, у которых этих антител не было.

Была обнаружена тенденция к наличию прямой корреляционной зависимости между частотой выявления в крови беременных анти-С и анти-Е антител и частотой развития тяжелого анемического синдрома и гепатоспленомегалии у новорожденных. Кроме того, было доказано, что отечный синдром у новорожденных достоверно чаще выявлялся при обнаружении в крови матери анти-Е антител.

Полученные данные позволили заключить, что выявление в крови беременных изолированно или в сочетании анти-D, анти-С и анти-Е антител имеет умеренную прогностическую значимость в отношении развития у плодов и новорожденных тяжелой степени анемической формы аллоиммунного заболевания.

Клиническое значение для развития заболевания у плода и новорожденного имеют иммуноглобулины класса G (IgG). Однако если у беременной в крови выявляются IgM, то следует наблюдать их в динамике беременности, поскольку с увеличением ее срока в крови матери, особенно из группы риска по развитию аллоиммунного заболевания, могут появиться и IgG.

Кроме того, у беременных, имеющих группу крови О (I), А (II), В (III) и супруга с иной группой крови, проводят выявление IgG системы АВО.

В процессе идентификации антител крайне необходимо исследовать принадлежность антител матери к субклассам IgG и определить их концентрацию в крови беременной. В литературе имеются данные о том, что если в сыворотке крови матери присутствуют только IgG, антитела, то интенсивность гемолиза эритроцитов у плода и новорожденного будет прямо зависеть от суммарного титра антител. Если присутствуют только IgG3 антитела, то гемолиз не будет зависеть от титра антител. Кроме того, в литературе имеются указания, что наиболее тяжелая анемия развивается у плода в том случае, если в крови матери выявляются совместно IgG1 и IgG3.

В работах, выполненных в НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, было показано, что в 50–70 % случаев у сенсибилизированных беременных, плоды которых нуждались во внутриутробных или постнатальных трансфузиях, встречалось сочетание IgG1 с IgG3 в различных концентрациях или их изолированное выявление в высокой концентрации – 1: 100. Так, IgG1 в титре 1: 100 были обнаружены у 86 % беременных, у плодов которых при рождении была обнаружена тяжелая аллоиммунная анемия. При этом IgG3 в концентрации 1: 100 выявляли во всех случаях, если пациентка имела очень высокий суммарный титр антиэритроцитарных антител (> 1:4096). A IgG3 в концентрации 1: 100 не были выявлены ни разу при уровне антител в крови матери ниже 1: 64.

Сочетание IgG1 и IgG3 было выявлено лишь у трети (39 %) беременных, плоды и новорожденные которых в инвазивном лечении не нуждались. При этом у большей части женщин эти антитела имелись в низкой концентрации. Кроме того, неагрессивные субклассы иммуноглобулинов – IgG2 и IgG4 – выявлялись только у беременных, не потребовавших фетальных операций.

В наших исследованиях не было обнаружено зависимости между каким-либо конкретным субклассом антиэритроцитарных антител, выявленным в крови сенсибилизированных беременных, и ультразвуковыми маркерами гемолитической болезни, обнаруженными у плода.

С целью подтверждения наличия гемолиза эритроцитов после родов в крови новорожденных выполняют непрямую реакцию Кумбса для выявления с помощью антиглобулиновых сывороток неполных эритроцитарных антител. Однако следует помнить, что результат этой реакции не всегда достоверно отражает наличие заболевания у плода.

В некоторых случаях может наблюдаться ложноотрицательный результат реакции Кумбса. С одной стороны, это может объясняться тем, что реакция выполняется с эритроцитами циркулирующей крови, в то время как основная масса эритроцитов, покрытых антителами, накапливается в крови, сконцентрированной в депо. С другой стороны, реакция Кумбса может быть отрицательна у новорожденных, имевших в антенатальном периоде неоднократные внутриутробные трансфузии из-за тяжелого течения аллоиммунного заболевания. В данном случае ложноотрицательная реакция Кумбса, наблюдающаяся у новорожденных, объясняется выраженным подавлением гемопоэза на фоне тяжелого гемолиза эритроцитов и циркуляцией большого объема донорской крови.

На рисунке 4 представлена сравнительная частота различных клинических проявлений гемолитической болезни, выявляющихся у новорожденных, при наличии в крови матери lgGx в различных концентрациях: 1:100 и 1:1.

Рис. 4. Сравнение встречаемости клинических проявлений гемолитической болезни новорожденных при выявлении в крови матери IgG 1 1:100 и 1:1

Как видно из рисунка 4 у новорожденных, имевших в крови матери IgG1 в высокой концентрации (1:100), чаще развивались желтуха, анемия и гепатоспленомегалия, а, следовательно, диагностировалась желтушноанемическая форма заболевания, чем у таковых, матери которых имели в крови антитела этого субкласса в низкой концентрации (1:1).

Таким образом, исследование в крови субклассов антиэритроцитарных антител позволяет сформировать группу риска сенсибилизированных беременных, имеющих риск развития у плода аллоиммунного заболевания, предполагать его тяжесть и форму. Однако по результатам иммуногематологических исследований невозможно установить тяжесть анемического синдрома у плода, а, следовательно, определить сроки проведения внутриутробных трансфузий.

Схема 1. Иммуногематологическое обследование беременных

Данные о группе крови, резус-принадлежности и аллоантителах пациентки выносят на лицевую страницу обменной карты беременной или истории родов.

Данный текст является ознакомительным фрагментом.